Skip to content
Kasım 11, 2009 / COBİD

Derleme: Deneyden Tedaviye RNA Sessizleştirilmesi

PDF-Derleme: Deneyden tedaviye RNA sessizleştirilmesi

Betül Çavuşoğlu, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Türkçe Bölümü 2. Sınıf

Antisens teknolojisi ve ribozimlerden sonra 1990’ların sonunda yeni bir mekanizma keşfedilmiştir: RNA interference. Bu mekanizma, ilk kez 2 botanikçi tarafından petunya çiçeklerinde, koyu renk elde etmek isterken, beyaz mor alacalı ve beyaz renkte çiçekler elde etmeleriyle fark edilmiştir [1]. Birkaç yıl sonra Andrew Fire ve Craig Mello, RNA molekülü enjekte edilen C.elegansın fenotipik özelliklerini incelemişler, dsRNA’yı ve bu RNA çeşidinin homologu olan mRNA’yı sessizleştirdiğini keşfetmişlerdir [2].

2000’li yılların başında, bu keşiflerden sonra, RNAi mekanizmasına ilgi daha da artmıştır. Araştırmacılar büyük bir hızla çalışmalarına devam ederken, klinikçiler de süregelen gelişmeleri heyecanla takip etmişlerdir. RNAi mekanizmasının tedavide umut eden bir yeri olduğu için, bu alanda olan her gelişme klinikçileri de yakından ilgilendirmiştir. 1999’da bu konuyla ilgili makale sayısı Pubmed’de sadece 31 iken, oysa 2009’da makale sayısı 21000’i bulmuştur [3]. Bu rakamlar arasındaki fark, artan ilgiyi çok iyi şekilde göstermektedir. Diğer araştırmacılar gibi Andrew Fire ve Craig Mello da çalışmalarına, sirke sineği, planarya, hidra, zebrafish ve memeliler üzerinde büyük bir hızla devam etmiş [4] ve 2006′ da tıp ve fizyoloji dalında Nobel kazanmışlardır [5].

Birçok patolojinin, anormal bir endojenik gen veya mutant gen nedeniyle hücreler arasında sinyalin bozulma, apoptoz, hücre proliferasyonu ile olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak viral enfeksiyon da yabancı gen ekspresyonu yaptırarak, hastalığa neden olmaktadır. siRNA mekanizmasıyla, yabancı gen ürünlerinin sessizleştirilerek, tedavide kullanılması düşünülmektedir [6].

Transkripsiyon-Translasyon

James Watson ve Francis Crick tarafından, 1953 yılında DNA’nın 3 boyutlu yapısının anlaşılması, moleküler biyolojinin temelini oluşturmaktadır [7]. Daha sonra, ökaryotik hücre DNA’sının, bu DNA’yı hücre nükleusunda düzenli bir şekilde paketleyen küçük bazik proteinlerle (histonlarla) sıkıca bağlı olduğu anlaşılmıştır [8].Histonlar sayesinde DNA’nın yalnızca istenilen bölgesi açılıp, sadece o bölgedeki genler transkribe edilir [9]. Bu sayede, her hücre bulunduğu bölgenin özelliğine göre davranır. Bir karaciğer hücresinin, bir sinir hücresinden farklı olmasının nedenlerinden biri de budur. Histonun istenilen bölgesi açıldıktan sonra helikaz DNA çift zincirini açar ve RNA polimeraz 2, DNA’nın promotor bölgesine bağlanır. Böylece pre-mRNA, transkribe edilmeye başlanır. Bir gen ürünü regülasyon mekanizması da, bu basamakta vardır. DNA’nın istenilen bölgesinin metillenmesiyle transkripsiyon faktörleri promotora bağlanamaz. Ve böylece DNA’nın istenilen bölgesi inaktive edilir [10]. Ayrıca promotor bölgesinin aktifliği de regülasyonda önemlidir. Pre-mRNA’nın protein sentezine kalıp olarak kullanılması için pre-mRNA önce sitoplazmaya taşınmalıdır. Ancak nükleus porlarından sitoplazmaya geçebilmesi için, bazı modifikasyonlara uğraması gerekir. mRNA’nın işlenmesinde ilk basamak, transkriptin 5’ucunun 7-metilguanozin başlık adı verilen yapının ve 3’ucuna ise poliA kuyruğunun eklenmesidir. İntronların da splysozomlar tarafından çıkarılmasıyla mRNA’mız, sitoplazmaya çıkmaya hazır hale gelir [11]. mRNAmız, sitoplazmaya çıktıktan sonraki aşamada, mRNA üzerinde de RNAi denen bir gen ürünü regülasyon mekanizması vardır. Bu mekanizma posttranskripsiyonel bir düzenleme mekanizmasıdır. mRNA’nın istenilen bölümünü sessizleştirerek, o bölgenin translasyonunu önler.

RNAi Interference

RNAi çok basamaklı bir mekanizma olup, birçok basamaktan aktive edilebilir. Sentetik dsRNA’lar ya da endojenik miRNAlar ile bu mekanizma tetiklenebilir [12]. Sentetik dsRNA, RNaz 3 endonukleaz Dicer tarafından siRNA denen 21-23 nükleotitlik kısa fragmentlere ayrılır. siRNA, RISC ( RNA induced silencing complex) ile etkileşir ve bu etkileşmeyi RISC’in yapısındaki Ago-2 proteini sağlar. siRNA, RISC’e çift zincirli olarak bağlanmışken, RISC’in yapısındaki Ago-2 proteini, bir zinciri serbest bırakır ve lider zincirin hedef zincire özgüllüğünü sağlar. mRNA, ona özgül olan siRNA tarafından tanınır ve sessizleştirilmek istenen bölge Ago-2 tarafından kesilir [13]. Sonraki araştırmalarda, bu mekanizmayı organizmanın aslında zaten kullandığı keşfedilmiştir. miRNA çekirdekte öncelikle pri-miRNA olarak eksprese edilir.

Pri-mRNA Rnaz 3 Drosha tarafından 70-90 bç lik fragmentlere bölünerek, pre-mRNA’lar elde edilir. Pre-mRNA’lar exportin 5’ten sitoplazmaya çıkar ve Dicer ile 21-23 bç’lik siRNA’lar elde edilir. siRNA’lar, dsRNA molekülleri ile aynı mekanizmayla komplementer mRNA moleküllerinin yıkımını sağlar [14].

Terapötik Kullanımı

RNA mekanizmasının tedavideki yeri her geçen gün daha da artmaktadır. Klinikçiler heyecanla yeni gelişmeleri takip etmektedirler. Çünkü RNAi’nin, dominant olarak aktarılan nörodejeneratif hastalıklar, otoimmun rahatsızlıklar, kanser ve viral enfeksiyonların tedavisinde yeni bir sayfa açacağı beklenmektedir [15]. Dominant olarak aktarılan nörodejeneratif hastalıklara örnek olarak Huntington hastalığı ve Alzheimer verilebilir. Spesifik bir gene bağlı hastalıklar oldukları için, o genin ürününü RNAi ile sessizleştirdiğimizde, bu tür hastalıkları büyük ölçüde tedavi edeceğimiz düşünülmektedir [16]. Hepatit C virüsü günümüzde dünya popülasyonunun yaklaşık %3 ünü enfekte etmiş ve tıp dünyasının tedavisi için üzerinde büyük bir hızla çalışmaya devam ettiği önemli bir virüstür [17]. Fare hepatositleri üzerinde invivo olan bir araştırmada antiHCB siRNA’ ların direkt olarak HCV sequensinin gen ürününü sessizleştirdiği görülmüştür [18]. Bu RNAi mekanizması için büyük bir adımdır ayrıca AIDS tedavisinde de başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Sentetik ve endojenik olarak sentezlenmiş siRNA’ların, HIV replikasyonunu, T lenfositler ve hematopoetik kök hücresinin ürettiği makrofajlar gibi birçok hücrede inhibe ettiği görülmüştür [19]. Çağın hastalığı olarak bilinen kansere karşı da birçok çalışma yapılmıştır. Kanserli dokuda miRNA mekanizmasının baskılandığı görülmüştür. Çünkü miRNA antiapoptotik gen olan Bcl-2’yi hedef alıp, onu sessizleştirebilir ve kanserli dokunun proliferasyonunu önleyebilir [20].

Bu tedavi çeşidinin tek bir allelde mutasyonla oluşan onkoloji ve genetik nörolojik hastalıklar alanında sadece defektif genin seçilerek bloke edilebilmesi en büyük avantajlarındandır. Ayrıca Antisens RNA’ya kıyasla daha düşük konsantrasyonda çok daha etkili olduğu görülmüştür [21]. Ama yine de tedavide sınırlayıcı etkileri yok değildir. Genler arasında paylaşılan bir diziyi hedef alırsa istenmeyen başka genleri de sessizleştirebilir, hücrenin RNAi mekanizmasını meşgul ederek, endojen miRNA fonksiyonlarını aksatabilir ya da antiviral hücrede bağışıklık yanıtını uyarabilir.

Sonuç

10yıl önce RNAi nin keşfi, moleküler biyoloji için bir dönüm noktası olmuştur. RNAi memelilerde gen fonksiyon çalışmalarında güçlü bir yöntem haline gelmiştir. Araştırmacıların istedikleri gen ürünü sessizleştirebilmelerini sağlamıştır. İnvivo çalışmalarla da viral ve nonviral hastalıklarda toksik etki olmadan tedavide kullanılabilecek güzel bir yöntem olduğu gösterilmiş ve gösterilmeye devam edilecektir. Gelecekte majör bir terapötik yaklaşım olacağı ve birçok hastalığın tedavisine ışık tutacağı umut edilmektedir.

Kaynaklar

1)van Blokland K, van der Geest N, Mol J, Kooter J. Transgene-mediated suppression of chalcone synthase expression in Petunia hybrida results from an increase in RNA turnover. Plant J. 1994; 6:861-77.

2) Dougherty WG, Parks TD. Transgenes and suppression: telling us something new? Curr. Opin. Cell Biol. 1995;7:399-405

3) Gonzales P. Paulson H.,Technology insight:therapeutic RNA interference how far from the neurology clinic?2007,394

4)Kennerdell JR, Carthew RW. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell 1998; 95:1017-26.

5)Scherr M,Eder M. Gene silencing by small regulatory RNAs in mammalian cells,15february 2007,444

6) Aigner A. Applications of RNA interference: current state and prospects for siRNA-based strategies in vivo , 2007,9

7)Cooper G.Hausman R.The Cell: A moleculer Approach,90

8-9) Cooper G.Hausman R.The Cell: A moleculer Approach,150

10)Bayne E.Allshire R.,RNA directed trancriptional gene silencing in mammals,july 2005,371

11)Cooper G.Hausman R.The Cell: A moleculer Approach ,264-276

12.-14)Scherr M,Eder M. Gene silencing by small regulatory RNAs in mammalian cells,15february 2007,445

13)Aagaard,L.Rossi J.J.,RNAi

therapeutics:Principles,prospects and challenges,2007

15-16)Gonzalez-Alegre P (2007) Therapeutic RNA

interference for neurodegenerative diseases: from

promise to progress. Pharmacol Ther 114: 34–55

17)Aagaard L.Rossi J.J.,RNAi therapeutics:Principles,prospects and challenges,2007 march,83

18) McCaffrey AP, Meuse L, Pham TT, Conklin DS, Hannon GJ, Kay MA. RNA interference in adult

mice. Nature 2002;418:38–39.

19)Aagaard L.Rossi J.J.,RNAi therapeutics:Principles,prospects and challenges,2007 march,84

20)Hammond S.,RNAi,miRNAs,and human disease,9 november 2006,65

21)Bertrand JR, Pottier M, Vekris A, Opolon P, Maksimenko A, Malvy C. Comparison of antisense

oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem Biophys Res Commun 2002;296:1000–1004